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WB的免疫印跡操作分享
發(fā)布時(shí)間: 2021-09-14 點(diǎn)擊次數(shù): 2494次①膜處理(甲醇 1min,風(fēng)干(放濾紙上),甲醇 1min,水 1min)
② 封閉(用 TBST 配 5%牛奶)1h 配搖床
③ 加一抗,牛奶稀釋,所需濃度參考抗體說(shuō)明書(shū),看膜的大小配多少一抗,4°過(guò)夜。
④ 室溫孵育 20min
⑤ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配搖床(0.1%TBST:tris12.1g,NaCl87.66g,HCl 至 PH7.6 后定容至 1L 后,加入 1ml 的 TWEEN20)
⑥ 加二抗,牛奶稀釋,一般 1:10000,1h 配搖床
⑦ 0.1%TBST 洗 10min x 3 次配搖床
⑧ 發(fā)光(A 液 B 液等體積混合,孵膜 1min,正面朝上放入儀器內(nèi)發(fā)光)
經(jīng)驗(yàn)總結(jié):
封閉液的選取具體得看抗體說(shuō)明書(shū),有的抗體是明確要求只能用 BSA,而且封閉液濃度的選擇也是具體得看抗體的要求,但是一般情況 5%BSA 的效果會(huì)比 5%牛奶要好。 信號(hào)通路一般都是用 5%BSA 封閉。 信號(hào)通路在洗膜的時(shí)候用快速搖床 5min/次 3 次就可以了。 如果你想省時(shí)間,一抗可以放在 37℃1~2hour,但是一定要封好,以免溫度太高而導(dǎo)致抗體 干了出現(xiàn)假陽(yáng)性。二抗可以 37℃半個(gè)小時(shí)。 發(fā)光液的選取,如果是一般的抗體,建議用一般的發(fā)光液效果會(huì)好一點(diǎn),如 keygen 的,背景會(huì)比較干凈。但是一些難發(fā)出來(lái)的一般建議用靈敏度更高的發(fā)光液如 FD 的或者是 MILLIPORE 之類的發(fā)光液。
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