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發(fā)高分 SCI,不會免疫組化(IHC)怎么行?
發(fā)布時間: 2021-09-07 點擊次數(shù): 1252次相信大家對 IHC 一定不陌生,世界那么大,實驗方法層出不窮,但是免疫組化卻是經(jīng)典中的經(jīng)典,想看看別的高大上的技術(shù)?不急,我們先來復(fù)習(xí)復(fù)習(xí)免疫組化。
免疫組化,免疫組織化學(xué)技術(shù)(immunohistochemistry),是一項利用抗原抗體反應(yīng),通過使標(biāo)記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原,對蛋白定位,定性的實驗技術(shù)。
免疫組化主要用的是組織標(biāo)本和細胞標(biāo)本兩大類,組織標(biāo)本包括石蠟切片(病理切片和組織芯片)和冰凍切片。石蠟切片,對組織形態(tài)保存好,保存時間也長,雖然對組織抗原暴露有影響,但可以抗原修復(fù),所以石蠟切片仍然是首先選擇的標(biāo)本制作方法。
好了,重點來了,下面是免疫組化步驟和經(jīng)驗,各位看官不要錯過哦!
① 在 60°烤箱烤片 30~60min,這一步是為了使蠟片水分蒸發(fā)和石蠟融化,好讓組織切片牢固貼在玻片上。做切片是免疫組化的前提切片子最好是找專業(yè)培訓(xùn)過的人員切片,片子的厚薄均勻,切片的完整,無褶無刀痕??佳械豆さ臅r候。
② 脫蠟水化,依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各 10min,乙醇梯度(高至低)各 2min,水。然后用自來水洗一下,但不要直接對著切片沖洗。
③ 抗原修復(fù),用的是高壓熱修復(fù),ph6.0 的檸檬酸鹽緩沖液,一定要全部浸泡切片,等高壓鍋冒氣后 5min 結(jié)束,自然冷卻,溫度驟降可能引起脫片哦。3%H2O2 避光浸泡 15min (當(dāng)然有的朋友用 EDTA 修復(fù)或者說使用微波修復(fù)等方法也是可以的,但是每一種抗體對不同的抗原修復(fù)方法的反應(yīng)是不一樣的,得具體對待。)
④ 這一步有神器,用“組傳"的免疫組化油筆圍繞組織畫圈,接下來就能看見它的功效了。 PBS 洗 5min x 3 次。PBS 會被鎖在畫的圈中,不會流干,保證不干片。
⑤ 滴加 5%BSA (BSA 用 PBS 溶)稀釋的一抗,每個組織約 20ul,用 200ul 的槍頭尖的一端抹平,4°過夜或者 37°1~2h,這里用的是第二種方法。(每種組織大小不一樣,面積大概 1 乘 1 的可以 20ul 就夠了,對于類似 NPC 的組織就沒必要這么大了,關(guān)于一抗的問題,個人建議 4°過夜的方法,當(dāng)然 37°1~2hour 也是可以的,兩種方法沒法說誰好誰不好,不同的抗體對方法的敏感性是不一樣的)再次 PBS 洗 5min x 3 次。
⑥ 滴加二抗,一滴每個,用 200ul 的槍頭尖的一端抹平,室溫靜置 30min。(貨號 GK500705 的二抗檢測試劑盒,很好用,極力推薦。)
⑦ 再次 PBS 洗 5min x 3 次
⑧ DAB- H2O2 顯色 10min。(B:C=1:50,25ul 每個,現(xiàn)配現(xiàn)用),在這時要觀察,如果染色明顯,不到 10 分鐘即可蒸餾水洗終止顯色,但是一般超過 20min 都不會有什么好結(jié)果。
⑨ Mayer 蘇木素染色 30s,水洗,鹽酸酒精分化 3s,流水浸 15min
⑩ 脫水,乙酸 2min,乙醇梯度(低至高)各 2min,二甲苯 5min
? 中性樹膠封片。
結(jié)果分析:
鏡下細胞核呈藍色,陽性結(jié)果呈深淺不一的棕色
結(jié)果分析主要有兩種方法,陽性著色細胞計數(shù)法和評分法。前者是在 40*光鏡下,隨機 10 個視野下計數(shù)陽性著色細胞;后者則是在光學(xué)顯微鏡下按染色程度(0 分陰性著色,1 分 淡黃色,2 分淺褐色,3 分深褐色)和陽性范圍(1 分 0-25%,2 分 26-50%,3 分 51-75%,4 分 76-100%)評分,最終分數(shù)相加。
再來看下反面教材
較為常見的非特異性著色;還有背景過深的。要避免成為上述的兩種典型,做出一張可以見老板的結(jié)果,每步都要且做且思考。
啰嗦幾句:
1、脫蠟和脫水的步驟呢,每個實驗室都有自己獨到的方法,用的乙醇的梯度不*相同,大家按照自己的習(xí)慣那套來就好。但要注意,脫蠟和水化不全引起局灶性反應(yīng),會導(dǎo)致非特異性著色。
2、一定要防止干片!干片也很容易引起非特異性著色。
3、在用槍頭抹平抗體時,要盡量將槍頭放平,用斜面而不要用尖頭接觸組織,這一步要輕柔小心,可能你只是輕輕刮到幾下,但鏡下組織就變得亂七八糟的了(別問我是怎么知道的)
4、PBS 在洗的時候,不要對著組織沖洗,會脫片。小編的方法是將沖洗著力點放在玻片的邊緣,讓液體自然流向組織。
5、一抗?jié)舛戎陵P(guān)重要,這直接影響了最終的結(jié)果,摸條件時設(shè)置一抗?jié)舛忍荻?。建議同時設(shè)置一個陽性對照,可以排除一抗之外的操作問題。
6、背景染色過深的話,就要考慮一抗?jié)舛冗^高或者一抗時間過長,顯色時間過長這些問題了。
7、降低組織非特異性染色,可以縮短一抗,二抗的時間,稀釋抗體,也可以增加幾次 PBS 沖洗?;蛘咧苯佑脝慰?。
免疫組化往往作為檢測某蛋白在組織的表達情況出現(xiàn)在預(yù)實驗中,免疫組化的結(jié)果可能將直接影響課題的后續(xù)設(shè)計和進展。如果說我們的科研課題是一個大世界的話,免疫組化是我們看向這個世界的敲門磚。做好免疫組化,我們一起去更大的世界看看!
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