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小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)的培養(yǎng)要點及高效轉(zhuǎn)染試劑
發(fā)布時間: 2021-07-13 點擊次數(shù): 8358次小鼠單核巨噬細胞白血病細胞(RAW264.7)是通過Abelson鼠白血病病毒誘導(dǎo)BALB/c小鼠產(chǎn)生腫瘤后得到的細胞株。其在醫(yī)學(xué)研究中應(yīng)用十分普遍,是許多白血病相關(guān)研究模型的常用細胞株,在微生物學(xué)、免疫學(xué)等研究中也十分常用。但RAW264.7細胞形態(tài)和分化狀態(tài)多變,在實際培養(yǎng)中較難把握,給科研工作帶來了一定困難;且RAW264.7細胞很難轉(zhuǎn)染,許多研究者表示Lipofectamine 2000根本轉(zhuǎn)不進去,或者僅有不到10%的轉(zhuǎn)染效率。因此RAW264.7細胞的培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染方法就很值得去探討,本文就這些方面進行介紹,以供科研工作者借鑒。
一、RAW264.7細胞的形態(tài)特征
很多人養(yǎng)RAW264.7細胞時發(fā)現(xiàn)自己的細胞出現(xiàn)偽足;就連ATCC的描述也稱RAW264.7細胞形態(tài)多樣,可有圓形、類圓形,以及長出偽足的長梭形、多邊形,可單核可多核。而實際,有偽足的情況是RAW264.7細胞受到外界刺激進行了分化,是細胞衰老、分化的表現(xiàn);RAW264.7細胞的“最佳"形態(tài)應(yīng)是較小的單核圓形細胞。
二、RAW264.7細胞的培養(yǎng)條件
RAW264.7細胞的培養(yǎng)環(huán)境與一般貼壁細胞并無差異。即培養(yǎng)箱溫度為37℃,CO2濃度為5%。ATCC推薦的培養(yǎng)基為DMEM+10%的胎牛血清;實際上,經(jīng)研究者們實驗發(fā)現(xiàn)高糖型DMEM培養(yǎng)的RAW264.7細胞傳代后貼壁更快、細胞生長速度更快。因此,推薦使用高糖型DMEM,F(xiàn)BS濃度為10%,作為RAW264.7細胞的培養(yǎng)基。
三、RAW264.7細胞的傳代
關(guān)于RAW264.7細胞的傳代方法,ATCC推薦使用細胞刮刀。也可采用0.25%的胰酶消化或采用彎嘴吸管吹打等方法。采用細胞刮刀進行傳代時,細胞能最大限度被收集起來,但會對細胞造成機械性損傷、影響細胞形態(tài)及貼壁時間等。采用胰酶消化時,由于RAW264.7細胞貼壁較牢,消化時間就較長。但消化時間點不易把握,易消化過度,對細胞生長造成抑制。
因此,推薦使用彎嘴吸管吹打進行傳代。具體做法是,當(dāng)細胞達到傳代密度時,先棄去培養(yǎng)基,用預(yù)冷的PBS洗滌兩次,用彎嘴吸管吸取培養(yǎng)基,均勻、稍用力吹打瓶底,即可將細胞吹打下來(吹不下來的就不要了),離心后重懸即可分瓶培養(yǎng)。2 h后可見細胞貼壁。
由于RAW264.7細胞生長速度較快,一般1-2d換液1次,密度長至60%-70%左右即可傳代,傳代比例可為1:3-1:6。若傳代間隔太久,細胞生長密度過大,細胞也容易發(fā)生分化,出現(xiàn)長偽足的多形細胞。
四、RAW264.7細胞的凍存及復(fù)蘇
RAW264.7細胞的凍存及復(fù)蘇方法與一般貼壁細胞并無較大差別。但由于RAW264.7細胞對外界刺激較敏感,對營養(yǎng)條件要求較高,許多人建議降低DMSO的濃度,增加FBS血清的濃度。因此凍存液的推薦配方為5% DMSO和20% FBS的培養(yǎng)基(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞的培養(yǎng)及其在誘導(dǎo)破骨細胞中的應(yīng)用,許丹等,中國骨質(zhì)疏松雜志,2016, 10, 22, 10)。
五、RAW264.7細胞的轉(zhuǎn)染
(一)以往轉(zhuǎn)染數(shù)據(jù)
RAW264.7細胞是一種巨噬細胞,有很強的貼壁性和偽足產(chǎn)生性,其轉(zhuǎn)染較難,一般采用電轉(zhuǎn)或慢病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法。有研究者對RAW264.7細胞用幾種不同的轉(zhuǎn)染方法進行處理,對轉(zhuǎn)染效率進行比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn),脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染(Lipofectamine 2000, Invitrogen)效率很低,僅為12.17±1.53%,慢病毒轉(zhuǎn)染效率是最高,可達34.75 ± 5.30%,羅氏轉(zhuǎn)染(X-treme GENE HP DNA Transfection Reagent, Roche)和電穿孔轉(zhuǎn)染效率分別為16.52 ± 3.86%和15.73 ± 3.29%(巨噬細胞RAW264.7不同轉(zhuǎn)染方法的比較,李亞等,生物技術(shù),2014, 24, 2)。
(二)最新高效轉(zhuǎn)染試劑
既然RAW264.7細胞這么難轉(zhuǎn)染,實驗還得繼續(xù),那怎么辦呢?
目前ZETA LIFE新推出一款A(yù)dvanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑。其廣泛適用于貼壁細胞和懸浮細胞的轉(zhuǎn)染,可轉(zhuǎn)DNA、RNA,也可共轉(zhuǎn)染,還可進行小動物活體轉(zhuǎn)染。
這一款轉(zhuǎn)染試劑有以下幾個特點:
1.適用細胞廣
廣泛用于293T,9L,A172, A375, A549, COS7, CHO-K1, C6S, C2C12, NIH3T3, RG2, T98G, U87, U118, MDCK, MCF-7, HT1080, HEK, H4, RAW264.7等多種細胞系。
2.細胞毒性低
其最高細胞存活率可高達98%,平均細胞存活率可達80%。
3.轉(zhuǎn)染效率高
其最高轉(zhuǎn)染效率可高達96%,平均轉(zhuǎn)染效率可達70%。
(三)Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染質(zhì)粒進RAW264.7的實例(來自實驗者的實際數(shù)據(jù))
由上圖可明顯看出Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑對RAW264.7轉(zhuǎn)質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率高達95%以上,且細胞存活率較高。
相信Advanced系列高效DNA、RNA轉(zhuǎn)染試劑 將是您對的選擇,希望能為您的研究助力。
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