文庫(kù)產(chǎn)出低，該不該上機(jī)？

①樣本丟失：細(xì)胞離心后在EP管中幾乎不可見(jiàn)，棄去上清液時(shí)容易造成丟失。建議在細(xì)胞離心過(guò)程中，將EP管統(tǒng)一方向并標(biāo)記細(xì)胞沉積位置，在沉淀對(duì)立面輕輕棄去上清，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中避免劇烈渦旋振蕩。

②不需要很糾結(jié)文庫(kù)產(chǎn)出，能夠達(dá)到上機(jī)標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)出，且文庫(kù)峰型符合ATAC文庫(kù)峰型，便可以上機(jī)測(cè)序。增加擴(kuò)增循環(huán)數(shù)，反而會(huì)導(dǎo)致dup 偏高。

ATAC文庫(kù)在進(jìn)行質(zhì)檢時(shí)，文庫(kù)呈現(xiàn)什么樣的分布是正常的分布？

轉(zhuǎn)座酶會(huì)容易與核小體間隔部分的DNA接觸，發(fā)生打斷反應(yīng)。構(gòu)建成功的ATAC文庫(kù)在2100峰圖上會(huì)呈現(xiàn)明顯的核小體的pattern特征峰，其中：

第一個(gè)在180-200bp的位置，屬于核小體之間的區(qū)域（40＋136）bp

第二個(gè)在300-400 bp

第三個(gè)在500bp左右

如果有第四個(gè)會(huì)在700bp附近

核小體全長(zhǎng)一般在180～200 bp，平均200 bp。其中，140多bp是直接盤(pán)繞在組蛋白八聚體核心外面，這些DNA不易被核酸酶消化；其余為核小體間區(qū)。不同組織、細(xì)胞，同一細(xì)胞染色體的不同區(qū)段，盤(pán)繞在組蛋白八聚體核心外面的DNA長(zhǎng)度是不同的，如：真菌的可短至154bp、海膽精子的可長(zhǎng)達(dá)260bp。

培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行ATAC-seq時(shí)支原體污染嚴(yán)重，使用支原體清除劑后，細(xì)胞是否能夠繼續(xù)進(jìn)行建庫(kù)？

支原體是原核生物，DNA呈裸露狀態(tài)，當(dāng)細(xì)胞被支原體感染，進(jìn)行ATAC-seq實(shí)驗(yàn)時(shí)，裸露的DNA會(huì)被切割，擴(kuò)增。使用支原體清除劑清除后，仍會(huì)有DNA殘留，進(jìn)行ATAC-seq實(shí)驗(yàn)捕獲的開(kāi)放區(qū)域占比少。存在污染時(shí)，污染會(huì)被放大。

Mapping 率低的原因與排查方案？

細(xì)胞培養(yǎng)或取樣過(guò)程中，有時(shí)會(huì)出現(xiàn)樣本被外源微生物污染的情況。ATAC建庫(kù)基于Tn5轉(zhuǎn)座酶切斷開(kāi)放DNA，而微生物基因組暴露程度高，相較真核宿主基因組更易發(fā)生轉(zhuǎn)座反應(yīng)。即使少量微生物污染，在所得文庫(kù)中也會(huì)占據(jù)較大比例。

可以從以下方面進(jìn)行排查：①確認(rèn)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)過(guò)程中有無(wú)污染；②確認(rèn)參考基因組是否選擇正確；③分析unmapping數(shù)據(jù)比對(duì)的物種類型。

Dup Rate 值偏高分析

Dup Rate一般與建庫(kù)中的PCR循環(huán)數(shù)相關(guān)。

①PCR擴(kuò)增帶有一定的偏好性和錯(cuò)配率，會(huì)影響最終形成文庫(kù)的覆蓋度和測(cè)序準(zhǔn)確性；

②PCR本身對(duì)于不同GC含量的樣本的擴(kuò)增效率是不同的，PCR循環(huán)越多，擴(kuò)增困難和擴(kuò)增容易的片段之間相差就會(huì)越大，對(duì)應(yīng)的分子多樣性就會(huì)越低，dup就會(huì)增大；

③PCR本身在擴(kuò)增的過(guò)程中可能會(huì)產(chǎn)生一些堿基的錯(cuò)配，錯(cuò)誤的擴(kuò)增可能會(huì)到出現(xiàn)與現(xiàn)有相同基因的結(jié)果，導(dǎo)致dup值升高。因此無(wú)需為獲得更高的文庫(kù)產(chǎn)量而設(shè)置過(guò)高的擴(kuò)增循環(huán)數(shù)。

轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近的信號(hào)分布

轉(zhuǎn)錄活躍的基因的TSS往往處于開(kāi)放狀態(tài)，以保證轉(zhuǎn)錄因子可以結(jié)合。所以，NFR fragments（開(kāi)放染色質(zhì)中兩個(gè)核小體之間的LinkerDNA片段）應(yīng)該富集在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSS）附近（圖中黑色實(shí)線），而結(jié)合核小體的區(qū)域在TSS位置應(yīng)該缺失且在TSS兩側(cè)相對(duì)富集（圖中紅色虛線）。

ATAC-seq 文庫(kù)是否可以兼容華大平臺(tái)測(cè)序？怎么做？

ATAC文庫(kù)可以兼容 Illumina和 MGI測(cè)序，且已驗(yàn)證所分析的下機(jī)數(shù)據(jù)結(jié)果一致。

上機(jī)測(cè)序方案：ATAC文庫(kù)構(gòu)建后，使用轉(zhuǎn)化試劑轉(zhuǎn)化為華大文庫(kù)，隨后進(jìn)行環(huán)化上機(jī)。

測(cè)序策略：推薦使用PE150。PE150為雙端測(cè)序，SE50為單端測(cè)序，由PE150測(cè)序所獲得的有效片段信息較SE50更多，因此獲得的數(shù)據(jù)更優(yōu)。

05 明星產(chǎn)品

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