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人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)
發(fā)布時(shí)間： 2023-01-12 點(diǎn)擊次數(shù)： 882次簡(jiǎn)介
胚胎干細(xì)胞是具有一種具有自我更新和全能分化能力的細(xì)胞，能發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調(diào)控機(jī)制理想的模型，也是用于人類疾病的干細(xì)胞治療和器官組織移植理-想的種子細(xì)胞。建立新的人類胚胎干細(xì)胞系仍然有很大的倫理學(xué)爭(zhēng)議，目前對(duì)人胚胎干細(xì)胞的研究主要就是基于已經(jīng)建立的人胚胎干細(xì)胞系的研究。
原理
人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)的原理是人胚胎干細(xì)胞快速生長(zhǎng)和擴(kuò)增，而細(xì)胞培養(yǎng)箱恰恰能提供培養(yǎng)所需的環(huán)境。
用途
胚胎干細(xì)胞常用于發(fā)育分化出成體所有的組織和器官，是體外研究發(fā)育調(diào)控機(jī)制理想的模型，也是用于人類疾病的干細(xì)胞治療和器官組織移植理-想的種子細(xì)胞。
材料與儀器
器材：①37 ℃ 水浴鍋②一次性無(wú)菌培養(yǎng)皿③一次性無(wú)菌移液管④T75培養(yǎng)瓶⑤15 mL 離心管、注射器和針頭⑥涂有明膠的6 孔 板試劑：①材料：提前制備好的飼養(yǎng)層細(xì)胞②95％乙醇步驟
人胚胎干細(xì)胞傳代培養(yǎng)的基本過程可分為如下幾步：（一）試劑配制
（1）膠原酶溶液的配制使用濃度1 mg ／mL 。膠原酶，30mg；DF12培養(yǎng)基，30 mL 。使膠原酶充分溶解于DF12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。用0.22 μm 濾器過濾除菌。（2）胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基的配制DF12培養(yǎng)基，200 mL ；血清替代物50 mL ；200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液，1.25 mL ；非必需氨基酸100x溶液，2.5 mL ；b-FGF 溶液，5 mL 。所有組分都加入250ml培養(yǎng)瓶中，用0.22μm濾器過濾除菌。培養(yǎng)基最好在2周內(nèi)使用。（3）200 mmol ／L -谷酰胺＋2-巰-基-乙-醇溶液的配制200 mmol ／L -谷酰胺，5 mL ；2-巰-基-乙-醇，7 μl ，混勻。
（4）b-FGF的配制b-FGF，10 μg ；0.1％BSA無(wú)菌，5 mL 溶解后按0.5 mL 每份分裝冷凍保存。（二）確定傳代時(shí)機(jī)
通常以下情況時(shí)，胚胎干細(xì)胞需要傳代①小鼠胚胎成纖維細(xì)胞（mouse embryonic fibroblasts，MEF）飼養(yǎng)層超過2 周 。②胚胎干細(xì)胞的克隆密度太高或克隆大小太大。③胚胎干細(xì)胞克隆出現(xiàn)分化現(xiàn)象。（三）膠原酶處理
（1）需要傳代時(shí)，將胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱取出，吸去培養(yǎng)上清。（2）6 孔板培養(yǎng)時(shí)，每個(gè)孔加1 mL 膠原酶溶液。（3）處理至少5 min 。（4）倒置顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞克隆從培養(yǎng)板表面脫離。注意：可以看到克隆周邊會(huì)出現(xiàn)皺褶。根據(jù)消化情況，膠原酶處理時(shí)間可再延長(zhǎng)6～10 min 。（四）刮細(xì)胞
（1）用5 mL 玻璃移液管，將細(xì)胞從培養(yǎng)板表面刮下來(lái)。（2）同時(shí)輕輕吹打膠原酶溶液，使細(xì)胞從培養(yǎng)板上面完-全脫離。（3）所有細(xì)胞團(tuán)都留在培養(yǎng)板中，直到整個(gè)6 孔 板都按步驟（1）、（2）處理完。
注意：這些步驟可以直視下完成，也可以在解剖纖維鏡下完成。
（五）收集并打散克隆
（1）將整塊6 孔 板的細(xì)胞都轉(zhuǎn)移到一個(gè)15 mL 離心管中。（2）每個(gè)孔加1 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基沖洗，并將沖洗液也轉(zhuǎn)移到細(xì)胞懸液中。（3）在15 mL 離心管中，輕輕吹打細(xì)胞懸液數(shù)分鐘，進(jìn)一步打散細(xì)胞克隆。注意：吹打時(shí)避免產(chǎn)生氣泡。（六）離心傳代
（1）將打散的細(xì)胞克隆，200 g 離心5 min 。（2）去除上清液。（3）輕輕拍散細(xì)胞團(tuán)，加2～3 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，輕輕混勻。（4）200 g 離心5 min 。（5）胚胎干細(xì)胞離心同時(shí)，將提前準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層培養(yǎng)板取出，吸棄MEF培養(yǎng)基。（6）用6 孔 板培養(yǎng)的飼養(yǎng)層，每個(gè)孔加1 mL PBS，輕輕晃動(dòng)，洗去培養(yǎng)基中所含的血清。
注意：PBS處理成纖維細(xì)胞的時(shí)間不要超過6～10 min 。
（7）胚胎干細(xì)胞離心結(jié)束后，棄去上清液，輕輕拍散細(xì)胞團(tuán)。（8）加入2～3 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞。（9）再加入足夠的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，使6 孔 板的每個(gè)孔細(xì)胞懸液體積為2.5 mL 。（10）去除飼養(yǎng)層培養(yǎng)板中的PBS，每個(gè)孔加入2.5 mL 細(xì)胞懸液，用移液管輕輕混勻。
（11）在水平臺(tái)面上，短促地上下左右地晃動(dòng)培養(yǎng)板，使加入的胚胎干細(xì)胞均勻分布到飼養(yǎng)層上。
（12）將培養(yǎng)的胚胎干細(xì)胞放入培養(yǎng)箱，使克隆重新貼壁。注意：在重新貼壁的這段時(shí)間內(nèi)，要盡量少開關(guān)培養(yǎng)箱，維持培養(yǎng)環(huán)境的穩(wěn)定，以利于胚胎干細(xì)胞重新貼壁。
（13）每天更換新鮮培養(yǎng)基。注意觀察克隆生長(zhǎng)狀態(tài)，在需要時(shí)按上述步驟再次傳代。（七）凍存
（1）按上述步驟收集胚胎干細(xì)胞細(xì)胞懸液，200 g 離心5 min 。（2）配好的凍存液（90％胎牛血清，10％DMSO）置于冰上備用。（3）棄去上清液，將細(xì)胞團(tuán)排松散后用凍存液重懸，逐滴加入凍存液，混勻。一般一個(gè)6 孔 培養(yǎng)板凍6 支 ，重懸時(shí)每個(gè)培養(yǎng)板的細(xì)胞加6 mL 凍存液。（4）迅速將1 mL 細(xì)胞懸液裝入1.5 mL 凍存管。蓋緊后放入異丙醇凍存盒中。（5）將凍存盒降至室溫后，轉(zhuǎn)入-80 ℃ 冰箱，保存過夜。（6）次日將凍存的細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐保存。注意：人胚胎干細(xì)胞凍存前不能將細(xì)胞消化成單細(xì)胞，消化后的細(xì)胞團(tuán)塊稍大為好。（八）復(fù)蘇
（1）將凍存的胚胎干細(xì)胞從液氮中取出，浸入37 ℃ 水浴，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，注意凍存管蓋不要沒入水中。（2）當(dāng)只剩一個(gè)小冰晶時(shí)，將凍存管從水浴中取出。（3）將凍存管浸入95％乙醇浴消毒，在無(wú)菌超凈臺(tái)中晾干。（4）將細(xì)胞從凍存管中轉(zhuǎn)入15 mL 離心管中，逐滴加入4 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，輕輕混勻。（5）200 g 離心5 min ，去除凍存液。（6）去除上清液，將細(xì)胞團(tuán)輕輕拍散，加2.5 mL 胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。（7）將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到鋪有照射后的飼養(yǎng)層細(xì)胞的6 孔 板中。每孔加2.5 mL 細(xì)胞懸液。飼養(yǎng)層細(xì)胞提前用1 mL PBS洗一遍，去除血清。（8）放入培養(yǎng)箱，第二 天 將細(xì)胞上面漂浮的死細(xì)胞吸去并換液，按常規(guī)方法繼續(xù)培養(yǎng)。（9）每天觀察細(xì)胞密度。按需傳代。注意事項(xiàng)
（1）所有試劑都應(yīng)記錄保質(zhì)期和批號(hào)，小包裝分裝保存，避免反復(fù)凍存。培養(yǎng)基配制后最好在2 周 內(nèi)用完。（2）胚胎干細(xì)胞克隆的消化液可有多種選擇，除了上文介紹的膠原酶消化，也可用0.05％的胰蛋白酶消化，消化時(shí)間比膠原酶消化所需時(shí)間要短，一般1～2 min ，待克隆周邊有皺褶時(shí)，要加用MEF培養(yǎng)基中止胰蛋白酶作用，其他步驟基本一致。（3）用消化傳代的時(shí)候務(wù)必不能將人胚胎干細(xì)胞消化成單個(gè)細(xì)胞，否則克隆形成率很低。（4）傳代時(shí)細(xì)胞密度很重要，人胚胎干細(xì)胞一般的傳代比例是1:5～1:10。接種的細(xì)胞太少不易生長(zhǎng)，最好4～6 d 傳代一次。（5）人胚胎干細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求很高，因此必須每天換液，細(xì)胞一般培養(yǎng)在6 孔 皿中。（6）一般使用第2～4 代 的小鼠成纖維細(xì)胞（MEF）作為飼養(yǎng)層細(xì)胞。細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿后一般在3 d 內(nèi)使用，放置時(shí)間過長(zhǎng)的飼養(yǎng)層細(xì)胞不利于人胚胎干細(xì)胞生長(zhǎng)。（7）人胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境是37 ℃ ，飽和濕度，5％CO2。培養(yǎng)箱應(yīng)當(dāng)每月清洗和衡一次，最好不要在同一培養(yǎng)箱內(nèi)再培養(yǎng)其他種類的細(xì)胞，以免交叉污染。
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