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    分離ARVM細(xì)胞

    發(fā)布時間: 2022-12-05  點擊次數(shù): 902次

    材料與儀器


    KH 緩沖液 混合氣體
    對流工作臺或?qū)恿魇匠瑑襞_ 乙酉迷罩 冷凝器 循環(huán)水浴和水浴搖床 圈型架 蠕動泵 臺式醫(yī)用離心機 無菌燒杯 ColorpHast pH 試紙

    步驟

    一、ARVM 細(xì)胞分離的準(zhǔn)備工作

    1. 準(zhǔn)備如下設(shè)備及器材:

    對流工作臺或?qū)恿魇匠瑑襞_

    乙酉迷罩 


    冷凝器

    循環(huán)水浴和水浴搖床

    帶夾的圈型架

    免蠕動泵

    臺式醫(yī)用離心機

    95% O2 5% CO2 混合氣體

    400 ml 無菌燒杯

    ColorpHast pH 試紙(精密型)

    2. 在對流式或?qū)恿魇焦ぷ髋_中,裝配 Langedorff 系統(tǒng),把冷凝器和三通管夾著固定在圈型架上,管子接上蠕動泵。冷凝器連接 37℃ 循環(huán)水浴,這樣溫水從冷凝器底部流進(jìn)從頂部流回水浴。

    3. 在工作臺的無菌區(qū)域,布置下列無菌器械,這些可以是高壓滅菌過的或一次性無菌器材:

    組織鉗

    大號剪刀

    彎頭小夾子 2 個

    小剪刀

    蚊式止血鉗

    Swinnex 25 mm 規(guī)格的濾器支架

    250 ml 燒杯

    玻璃管和硅膠管

    帶螺蓋的,50 ml 錐形瓶,內(nèi)加小攪拌棒

    帶螺蓋的 250 ml 錐形瓶

    一次性培養(yǎng)皿,吸管,60 ml 注射器,15 ml 和 50 ml 離心管,縫合線

    4. 準(zhǔn)備加 CaCl2 和不加 CaCl2 的 Krehs-Henseleit(KH)培養(yǎng)基,過濾除菌 37℃ 保溫。

    5. 充氧飽和 KH 緩沖液和無鈣 KH 培養(yǎng)基直到 pH 值約 7.4。轉(zhuǎn)移 150 ml 氧飽和的無鈣 KH 緩沖液至無菌的 250 ml 帶螺帽錐形瓶中并置于 37℃ 水浴。螺帽務(wù)必蓋好。

    6. 制備酶溶液Ⅰ。裝有氧飽和的無鈣 KH 緩沖液的錐形瓶中加 75 mg 的膠原酶和 45 mg 的透明質(zhì)酸酶。

    7. 制備酶溶液Ⅱ。取 21 ml 溶液Ⅰ轉(zhuǎn)移至一支新管中,加 2 ml 胰酶和 20 μl 無菌 1 mol/L CaCl2 過濾除菌。膠原酶/透明質(zhì)酸酶溶液移至一無菌的 250 ml 的帶螺帽錐形瓶中,膠原酶/透明質(zhì)酸酶/胰酶液移至一無菌的 50 ml 帶螺帽錐形瓶中。

    8. 往第一個 250 ml 燒杯中加 150 ml KH 緩沖液,并加入灌注系統(tǒng),避免產(chǎn)生氣泡。在插管處檢查流過液的 pH 值,通以 95% O2/5%CO2 氣體將 pH 值調(diào)回 7.4。流出液體回收到無菌 400 ml 燒杯中。

    9. 用預(yù)溫的 KH 緩沖液覆蓋整個平皿底。

    10. 把第一只鼠放進(jìn)乙酉迷罩 中麻醉。

    11. 把充過氧的無鈣 KH 緩沖液放進(jìn)第二只 250 ml 無菌燒杯中,將流速調(diào)高至 5.5 ml/min,灌注 6 分鐘。

    12. 酶溶液Ⅰ放進(jìn)第三只 250 ml 燒杯中,泵速度調(diào)節(jié)至 8 ml/min,灌注 5 分鐘。把該 250 ml 燒杯放在心臟下面繼續(xù)重新灌注心臟 15 分鐘以上。

    二、解剖動物和灌注心臟

    1. 動物被麻醉后,放在 Langendorff 裝置的附近。動物平躺放置,用乙醇浸潤胸部剪開胸部皮毛。

    2. 用大剪刀在肋骨下切一橫向切口打開胸腔,然后切開胸膈膜。

    3. 提起劍突,胸中線兩邊約 2 cm 處沿肋骨各做一條徑向切口,千萬不要觸及心臟。

    4. 用夾子掂起心臟,剪斷下方的連接,摘下心臟和胸腺,摘下的心臟放在裝有 KH 溶液的佩特里氏平皿,然后轉(zhuǎn)到支著灌注設(shè)備的工作臺上。

    5. 把心臟移到平皿的邊緣,提起胸腺露出主動脈,用小剪刀剪掉胸腺。

    6. 打開泵,流速調(diào)至約每秒一滴。雙手穩(wěn)握兩把小鉗子,使主動脈沿插套滑動至插套管底部位于心臟的頂部。

    7. 用蚊式止血鉗固定住心臟,鉗子夾著主動脈底部并保證止血鉗夾著主動脈上端。

    8. 在止血鉗下部,用縫合線牢固地綁住心臟,灌注 3~5 分鐘使心臟血全部排出。

    9. 從心臟上剔除殘余組織,保持肺動脈以及動脈附屬件的完整性。

    三、心臟組織的消化

    1. 酶溶液Ⅰ進(jìn)行灌注的最后 2 分鐘時,用 colorp Hast 試紙檢查液體的 pH 值,若有必要,通氣調(diào)節(jié) pH 至 7.4。

    2. 從插套管上割下心室并仔細(xì)切成 1 mm2 的小塊。轉(zhuǎn)入裝有酶溶液Ⅱ 的 50 ml 錐形瓶中,于 37℃ 水浴,100 r/min 搖動孵育 15 分鐘。

    3. 用 5 ml 吸管稍微吹打上述樣品后轉(zhuǎn)入一支 50 ml 錐形離心管中加 20 ml 洗滌培養(yǎng)基。

    4. 一支 60 ml 注射器,拿掉推桿,裝上 Swinnex 濾器。往針筒內(nèi)加入細(xì)胞懸液,把細(xì)胞過濾到一支新管中。

    5. 500 r/min(50 g)離心 30 秒,去上清后,細(xì)胞重新溶于 10 ml 新的洗滌培養(yǎng)基中。

    6. 讓梭形細(xì)胞沉降 20 分鐘,小心去上清,用 10 ml 新洗滌培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

    7. 讓細(xì)胞沉降 15 分鐘,去上清,用 10 ml 洗滌培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

    8. 重復(fù)上述洗滌步驟,共洗 4 次,最后一次洗滌后,倒去上清。加入 5 ml 洗滌培養(yǎng)基。

    9. 重懸細(xì)胞后小心鋪放在 DMEM 配制的 6% BSA溶液上層,讓梭形細(xì)胞沉降 10~15 分鐘。

    10. 最后的細(xì)胞團(tuán)應(yīng)包含高比例的活的梭形心室心臟細(xì)胞。每只心臟若能收到 3X106 個細(xì)胞就很不錯了。

    四、ARVM 細(xì)胞的培養(yǎng)

    1. 在上述細(xì)胞洗滌的同時,準(zhǔn)備包被平板/蓋玻片/載玻片于室溫,用 10 μg/ml 層黏素溶液浸沒 30 分鐘。

    2. 加入適量的培養(yǎng)皿重懸最后所得的細(xì)胞團(tuán),并以每只 100 mm 規(guī)格平皿 1X106 個細(xì)胞的量接種至已包被過的平板上。

    3. 讓細(xì)胞貼壁 1 小時,然后換新的培養(yǎng)基連續(xù)孵育。用加血清或不加血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 1 或 2 周。

    4. 細(xì)胞隔天換液。


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