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    細(xì)胞傳代培養(yǎng)實驗常見問題詳解

    發(fā)布時間: 2021-12-23  點擊次數(shù): 1699次

    01 一般拿到細(xì)胞后,應(yīng)該注意什么?


    收到細(xì)胞先不開蓋,用酒精將整個細(xì)胞瓶外壁進行消毒,放在培養(yǎng)箱靜置若干小時后(看細(xì)胞密度而定)在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況,并對細(xì)胞進行不同倍數(shù)拍照(建議收細(xì)胞時的培養(yǎng)基拍一張照片,觀察培養(yǎng)基的顏色和是否有漏液情況,顯微鏡下拍細(xì)胞100X,200X各兩張),排除細(xì)胞本身污染的情況。


    02 何時須更換培養(yǎng)基?

    視細(xì)胞生長密度而定,常規(guī)細(xì)胞2-3天更換培養(yǎng)基。


    03 細(xì)胞何時進行傳代較好?

    一般情況下細(xì)胞生長至*匯合后就應(yīng)該傳代,所有細(xì)胞生長都有一個要求不宜生長過密(也就是常說的長老了),但有接觸抑制的細(xì)胞,在匯合前就必須進行傳代,這類細(xì)胞一般在密度70-80%就進行傳代,否則會引起細(xì)胞分化。


    04 貼壁細(xì)胞如何進行傳代?

    去掉原T25培養(yǎng)瓶里面的培養(yǎng)基,T25瓶加3-4 ml PBS洗1-2次;棄PBS,再加1.5 ml的Trypsin-EDTA (1X)消化液消化細(xì)胞,顯微鏡下觀察,待細(xì)胞變圓,細(xì)胞間隙明顯,部分細(xì)胞剛開始脫離瓶壁,加4 ml左右*培養(yǎng)液混勻終止消化,將細(xì)胞小心吹打下來,1000 rpm/min室溫離心5min;棄上清,細(xì)胞沉淀用*培養(yǎng)液重懸,按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:2-1:3,1:3-1:6,1:6-1:8),每T25瓶補足培養(yǎng)基至5-6 ml,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。


    05 懸浮性細(xì)胞應(yīng)如何傳代處理?


    一般僅需持續(xù)加入新鮮培養(yǎng)基于原培養(yǎng)角瓶中,稀釋細(xì)胞濃度即可,若培養(yǎng)液太多時,將細(xì)胞懸液移入離心管中,1000 rpm/min 室溫離心5 min。棄上清,細(xì)胞沉淀用*培養(yǎng)液重懸,按要求分瓶(視細(xì)胞密度而定1:4-1:8),每T25瓶加*培養(yǎng)液至4-5 ml,37℃、5%CO2孵箱培養(yǎng)。有些懸浮細(xì)胞趨于成團生長,此時細(xì)胞生長狀態(tài)良好,當(dāng)補液時,需避免反復(fù)吹打。


    06 貼壁細(xì)胞傳代如何使用胰酶?

    一般使用trypsin-EDTA濃度為0.25% trypsin-0.53 mM EDTA.2Na或0.05%trypsin-0.02 mM EDTA.2Na。消化液濃度過高時,易造成培養(yǎng)基中細(xì)胞碎片增多,黑渣子增多,常規(guī)細(xì)胞傳代時建議用0.05%的胰酶進行消化,對于難消化的細(xì)胞可采用0.25%胰酶進行消化,細(xì)胞密度過高超過80%時,采用分步消化法。胰酶儲存在–20°C,解凍在4°C進行,第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中,保存于–20°C,避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin之活性降低,并可減少污染之機會。


    07 如何控制胰酶消化時間?


    胰酶消化的程度是細(xì)胞培養(yǎng)中的一個關(guān)鍵步驟:消化過度細(xì)胞碎片增多,黑渣子增多,細(xì)胞會成片脫落,嚴(yán)重影響細(xì)胞活性,并有部分細(xì)胞漂浮,隨棄去的胰酶流失;消化不足則細(xì)胞難于從瓶壁上吹下,反復(fù)吹打同樣也會損傷細(xì)胞活性。

    不同細(xì)胞對消化液的敏感性不同,胰酶消化的時間也會有差異。胰酶消化時間與胰酶的濃度,是否含EDTA,胰酶的儲存時間,胰酶的儲存溫度,是否反復(fù)凍融,消化加入的胰酶體積,消化溫度及細(xì)胞的密度有關(guān)。消化對于新購買的細(xì)胞,建議客戶先用低濃度的胰酶仔細(xì)去摸索一下消化時間,可每隔1分鐘鏡下觀察細(xì)胞是否變圓,記錄最佳消化時間,下一次操作參考之前的記錄來控制時間即可。


    08 細(xì)胞離心下來的離心速率應(yīng)為多少?

    細(xì)胞傳代或凍存時欲回收細(xì)胞,其離心速度一般為800-1000 rpm/min,室溫離心5-8分鐘,轉(zhuǎn)速過高,將造成細(xì)胞破裂死亡。


    09 如何區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞?

    顯微鏡下觀察:活細(xì)胞中間透亮,飽滿,有光澤,死細(xì)胞較暗。也可以通過臺盼藍(lán)染色來計算細(xì)胞活力。


    10 如何用臺盼蘭計數(shù)活細(xì)胞?

    用無血清培養(yǎng)基把細(xì)胞懸液稀釋到200~2000 個/毫升,在0.1 毫升的細(xì)胞懸液中加入0.1 毫升的0.4%的臺盼蘭溶液。輕輕混勻,用血球計數(shù)板計數(shù)細(xì)胞?;罴?xì)胞排斥臺盼蘭,因而染成藍(lán)色的細(xì)胞是死細(xì)胞,注意計數(shù)需在加入臺盼藍(lán)10min內(nèi)完成。有細(xì)胞計數(shù)儀的,可直接用計數(shù)儀進行。


    11 二價離子抑制胰蛋白酶活性嗎?

    二價離子的確抑制胰蛋白酶活性。


    12 使用胰蛋白酶加入EDTA是為什么?

    EDTA用來螯合游離的鎂離子和鈣離子,以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建議胰蛋白酶處理細(xì)胞前,用EDTA清洗細(xì)胞,以消除來自培養(yǎng)基中所有的二價離子。


    13 可否使用與原先不同的培養(yǎng)基?

    不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基,若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,細(xì)胞大都無法立即適應(yīng),易造成細(xì)胞狀態(tài)不好,最終造成細(xì)胞無法存活。


    14 可否使用與原先不同的血清種類?


    不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個極為重要的營養(yǎng)來源,所以血清的種類和品質(zhì)對于細(xì)胞的生長會產(chǎn)生極大的影響。來自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,血清使用錯誤常會造成細(xì)胞無法存活。


    15 細(xì)胞為何生長不均勻?

    細(xì)胞傳代后放入培養(yǎng)箱沒有搖勻,或者放入時搖勻,但在細(xì)胞貼壁前,又移動了培養(yǎng)瓶,頻繁開關(guān)培養(yǎng)箱引起的振動或者培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)液過少,培養(yǎng)箱擱板表面不平整,這些因素會導(dǎo)致細(xì)胞生長不均勻。


    16 購買的細(xì)胞死亡或細(xì)胞存活率不佳

    研究人員在細(xì)胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳,常見原因可歸納為:培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質(zhì)不佳。血清使用錯誤或血清的品質(zhì)不佳。運輸過程對細(xì)胞有嚴(yán)重影響。解凍過程錯誤。冷凍細(xì)胞解凍后,加以洗滌細(xì)胞和離心。懸浮細(xì)胞誤認(rèn)為死細(xì)胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細(xì)胞置于–80°C太久。


    17 細(xì)胞抱團怎么處理?

    一些懸浮細(xì)胞抱團生長是正?,F(xiàn)象,大部分懸浮細(xì)胞在細(xì)胞密度很高的情況下,很可能會出現(xiàn)部分細(xì)胞抱團生長的現(xiàn)象,聚團細(xì)胞很容易死亡并演化成絮狀物,殃及周圍的懸浮細(xì)胞,因此在培養(yǎng)懸浮細(xì)胞時需控制好細(xì)胞密度。如果出現(xiàn)了細(xì)胞團,可以通過細(xì)胞篩去掉部分較大的細(xì)胞團,也可以嘗試一下方法:將細(xì)胞懸液收集到15 ml離心管中,靜置20 min左右,小心取上層細(xì)胞上清培養(yǎng)(該方法只能去除部分較大的細(xì)胞團)。


    18 細(xì)胞內(nèi)有空泡,是否是正?,F(xiàn)象?

    部分細(xì)胞本身存在一定的空泡(如HepG2,Ishikawa及一些耐藥株等),這個是正常現(xiàn)象。如果只有少數(shù)細(xì)胞有內(nèi)出現(xiàn)極少空泡,則很可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳,可以通過調(diào)整血清濃度,控制消化,控制傳代比例及時間等方法來調(diào)整細(xì)胞狀態(tài);如果大部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡,且單個細(xì)胞內(nèi)空泡數(shù)目偏多,則可能細(xì)胞代次較高,細(xì)胞老化所致,需更換代次較早的細(xì)胞。


    19 細(xì)胞傳兩代后開始逐漸死亡的原因

    很可能是培養(yǎng)體系不適合細(xì)胞(未使用推薦的培養(yǎng)體系);或者消化過度,對細(xì)胞有嚴(yán)重影響;或者是傳代比例不合適(具有密度依賴性的細(xì)胞,傳代太稀;或者生長較快的細(xì)胞,傳代較密,細(xì)胞嚴(yán)重堆疊生長)。


    20 細(xì)胞生長逐漸變慢是什么原因?


    細(xì)胞增殖變慢有以下原因:1. 消化過度 2. 傳代過密 3.細(xì)胞營養(yǎng)不良 4.細(xì)胞頻繁傳代 5.細(xì)胞狀態(tài)不佳或老化 6.細(xì)胞存在污染。



    21 培養(yǎng)細(xì)胞時應(yīng)使用5%或10%CO2?

    一般培養(yǎng)基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作為pH的緩沖系統(tǒng),而培養(yǎng)基中NaHCO3的含量將決定細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用的CO2濃度。當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3含量為每公升3.7 g時,細(xì)胞培養(yǎng)時應(yīng)使用10% CO2;當(dāng)培養(yǎng)基中NaHCO3為每公升1.5 g時,則應(yīng)使用5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞。


    22 CO2培養(yǎng)箱之水盤如何保持清潔?

    定期(每周一次)更換水盤里面的水,水盤的水必須使用無菌蒸餾水或無菌去離子,水盤中可添加1%硫酸銅以預(yù)防霉菌污染。


    23 細(xì)胞接種密度多少合適?

    依照細(xì)胞株基本數(shù)據(jù)上的接種密度或稀釋分盤的比例接種即可。細(xì)胞數(shù)太少或稀釋的太多亦是造成細(xì)胞無法生長的一個重要原因。按照我們的經(jīng)驗:一般倍增時間24 h內(nèi)的細(xì)胞,傳代比率1:6-1:12為宜,倍增時間24-48 h的細(xì)胞,傳代比率1:3-1:8為宜,倍增時間超過48h的細(xì)胞, 傳代比率1:2-1:4為宜。


    24 培養(yǎng)中常出現(xiàn)一些黑點,是污染嗎?

    首先肉眼觀察培養(yǎng)液是否變渾濁,如果變渾濁,基本可以確定是污染;如果肉眼觀察培養(yǎng)液沒有變渾濁:在顯微鏡下觀察黑點大小和形狀是否規(guī)則,是否運動,是做布朗運動還是呈直線型快速移動。如果黑點大小不規(guī)則,做布朗運動,黑點可能是細(xì)胞碎片(可能是細(xì)胞狀態(tài)不佳或者消化過度引起的),也可能是血清反復(fù)凍融產(chǎn)生的蛋白沉淀引起的,也可能是細(xì)胞的代謝產(chǎn)物。如果黑點大小一致,快速移動,很可能是細(xì)菌污染。


    25 如何預(yù)防細(xì)胞培養(yǎng)中黑點的產(chǎn)生?

    掌握細(xì)胞傳代的最佳時機,不要細(xì)胞長老了再傳代;掌握好消化時間,防止消化過度產(chǎn)生細(xì)胞碎片;減少血清等試劑的凍融次數(shù);將培養(yǎng)液的PH調(diào)到最佳;嚴(yán)格控制水質(zhì)和器皿的清潔。


    26 黑點已經(jīng)產(chǎn)生了,如何進行處理?

    如果判定黑點是污染,請及時將細(xì)胞處理后丟棄。其他情況,可參照以下進行:

    如果是懸浮細(xì)胞:收集細(xì)胞上清慢速離心(500-600 rpm/min,5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶;如果是貼壁細(xì)胞:將細(xì)胞用PBS洗2-3遍,洗的時候,輕輕拍打培養(yǎng)瓶,讓貼壁不牢的碎片和顆粒脫落,再棄去PBS,消化時先加低濃度的胰酶如0.05%胰酶消化1 min左右,讓細(xì)胞間隙中的顆粒和碎片脫落下來,去掉低濃度胰酶,然后正常消化細(xì)胞,將收集的細(xì)胞懸液慢速離心(500-600 rpm/min,5-6 min)并更換新的培養(yǎng)瓶,并可以嘗試適當(dāng)增加血清濃度進行培養(yǎng)。


    27 培養(yǎng)用dish,flask是否相同?

    不同廠牌的dish或flask,其所coating的polymer不同,制造程序亦不同,雖對大部分細(xì)胞沒有太大之影響,惟少數(shù)細(xì)胞則可能因使用廠牌不同之dish或flask而有顯著之生長差異。




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