接上一期，本期我們繼續(xù)分享細(xì)胞培養(yǎng)常見的問題吧~

12. 附著性細(xì)胞繼代時(shí)所使用的trypsin-EDTA 濃度？應(yīng)如何處理？

一般使用的trypsin-EDTA 濃度為0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于-20 ℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成trypsin 的活性降低，并可減少污染的機(jī)會。

13. 欲將一般動(dòng)物細(xì)胞離心下來，其離心速率應(yīng)為多少轉(zhuǎn)速？

回收動(dòng)物細(xì)胞，其離心速率一般為300xg (約1 000 rpm)，5-10 分鐘，過高的轉(zhuǎn)速，將造成細(xì)胞死亡。

14. 細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基的成份為何？

動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原來細(xì)胞生長用的新鮮培養(yǎng)基均勻混合之。注意：由于DMSO 稀釋時(shí)會放出大量熱能，故不可將DMSO 直接加入細(xì)胞液中，必須使用前先行配制完成。

15. DMSO 的等級和無菌過濾的方式為何？

冷凍保存使用的DMSO 等級，必須為Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即為無菌狀況，第一次開瓶后應(yīng)立即少量分裝于無菌試管中，保存于4℃，避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO 的裂解而釋出有害物質(zhì)，并可減少污染的機(jī)會。若要過濾DMSO，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質(zhì)濾膜。

16. 冷凍保存細(xì)胞的方法？

冷凍保存方法一：冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ (-20℃ 30 分鐘*) → -80℃16~18 小時(shí)(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 長期儲存。

冷凍保存方法二：冷凍管置于已設(shè)定程序的可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。*-20℃不可超過1 小時(shí)，以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡，亦可跳過此步驟，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。

17. 細(xì)胞欲冷凍保存時(shí)， 細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度？

冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial，融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。 

18.培養(yǎng)基中是否須添加抗生素？ 

除于特殊篩選系統(tǒng)中外，一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下，培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素。

19. 應(yīng)如何避免細(xì)胞污染？

細(xì)胞污染的種類可分成細(xì)菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉?jié){菌。主要的污染原因?yàn)闊o菌操作技術(shù)不當(dāng)、操作室環(huán)境不佳、污染的血清和污染的細(xì)胞等。嚴(yán)格的無菌操作技術(shù)、清潔的環(huán)境、與品質(zhì)良好的細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制是減低污染的最好方法。當(dāng)然，適當(dāng)添加抗生素也是防止細(xì)胞污染的途徑。

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