做好流式太難？可能方法就用錯了，解決思路看這里!

發(fā)布時間： 2021-11-02　　點擊次數(shù)： 2198次

流式細(xì)胞術(shù)（FCM）是利用流式細(xì)胞儀對單個細(xì)胞或者生物微顆粒的生物學(xué)性質(zhì)進行分析的檢測方式。其特點是能夠快速、精準(zhǔn)的分析單個細(xì)胞的多種特性，適用于定性、定量分析細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中的各種細(xì)胞成分，還可以研究細(xì)胞的各種功能狀態(tài)等，特別適用于大量樣品的檢測。

現(xiàn)已被廣泛用于免疫學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、血液學(xué)、腫瘤學(xué)、微生物學(xué)等多個領(lǐng)域。典型的應(yīng)用實例包括血液系統(tǒng)疾病的免疫分型，腫瘤學(xué)中細(xì)胞 DNA 的倍體和周期分析，細(xì)胞生物學(xué)研究中的細(xì)胞凋亡、增殖，細(xì)胞表面或胞內(nèi)的抗原檢測等。

其中，流式技術(shù)較為廣泛的應(yīng)用是使用流式抗體進行細(xì)胞的分型鑒定，常見的免疫表型分析實驗包括單細(xì)胞懸液制備、細(xì)胞表面或胞內(nèi)抗體的染色、上機檢測等基本步驟。

兩種常見流式細(xì)胞標(biāo)記法

直接法和間接法各有利弊

直接法：熒光標(biāo)記的抗體直接與細(xì)胞的抗原結(jié)合，一步孵育后即可以進行細(xì)胞的流式上機檢測。直接法因為其方便快捷，交叉反應(yīng)和背景少，是目前主流的流式標(biāo)記手段。

間接法：細(xì)胞先與一抗進行孵育，然后熒光二抗再結(jié)合到一抗上形成免疫檢測復(fù)合物，后續(xù)即可以進行上機。當(dāng)商品化的直標(biāo)抗體無法獲得時，間接法可以作為補充，但間接法在多色實驗中很難避免種屬間的交叉反應(yīng)，選擇性會大大受到影響。

兩種流式細(xì)胞標(biāo)記法原理見圖 1。

圖 1 流式抗體標(biāo)記常見的兩種形式

（左圖為直接法，右圖為間接法）

除選擇上述兩種商品化標(biāo)記抗體外，還可使用抗體標(biāo)記試劑盒標(biāo)記抗體，獲取實驗所需的熒光標(biāo)記抗體，但該方法對技術(shù)要求高，標(biāo)記效果往往受多種因素影響。常見的傳統(tǒng)流式細(xì)胞標(biāo)記方法，見表 1。

表 1 常見的傳統(tǒng)流式細(xì)胞標(biāo)記方法

因素	直接法	間接法	標(biāo)記試劑盒
耗時	一步操作，耗時少	多步操作，耗時長	耗時更長，往往需 1 個小時甚至數(shù)天
復(fù)雜性	不復(fù)雜，流程短	復(fù)雜，必須選擇合適的二抗，多色實驗中很難避免種屬間的交叉反應(yīng)	流程更復(fù)雜，需要考慮多種因素如抗體濃度、專業(yè)技術(shù)知識、反應(yīng)清洗等
靈活性	不靈活，商品化決定	靈活，使用不同的二抗可拓寬可測量靶標(biāo)的范圍	操作更靈活，可人工組合偶連
靈敏度	低于間接法	反饋更靈敏，一抗上可結(jié)合多個二抗分子	低于間接法
背景	低背景，減少了非特異結(jié)合	更多背景，可能存在內(nèi)源性結(jié)合	更多背景，操作復(fù)雜，任何環(huán)節(jié)出錯均會影響結(jié)果

多色流式分析

可同時定量檢測細(xì)胞多種特性但要求高

隨著流式細(xì)胞儀、單克隆抗體和熒光探針的不斷發(fā)展，流式分析已經(jīng)從早期的單激光單色檢測，發(fā)展到可快速同時定量檢測一種細(xì)胞的多種特性，多色多參數(shù)多激光的檢測分析。

同時分析多個抗原或多種細(xì)胞特性的能力為越來越復(fù)雜的實驗打開了新的大門，但多色流式細(xì)胞分析需要平衡多個難題的解法，包括儀器配置、抗原表達(dá)和染料亮度，以及可用的抗體- 染料組合等，考慮的要素見圖 2。

圖 2 流式多色方案設(shè)計需要考慮的要素

流式的配色需要綜合考慮以下因素：

儀器的配置：抗體所選擇的熒光染料必須根據(jù)儀器的激光通道以及相應(yīng)的濾片配置進行選擇。

抗原的表達(dá)量：待測細(xì)胞類群的豐度以及熒光染料的亮度。常見的配色原則是將亮度高的染料配給低豐度的抗原或者低豐度細(xì)胞上的抗原。

熒光標(biāo)記的抗體的可選擇性：從供應(yīng)商處選擇流式驗證過的符合配色需求的抗體，如果無法找到合適的供應(yīng)商，則可以考慮使用熒光二抗進行間接標(biāo)記，但這種方案可能會造成種屬間的交叉反應(yīng)以及高背景的問題。

如果研究人員無法在一次實驗中妥善調(diào)和上述因素，就需要退而求其次，進行多次分析。而多次分析難免引入各不相同的實驗條件，由此造成的數(shù)據(jù)波動最終會導(dǎo)致數(shù)據(jù)結(jié)果不可靠。

默克創(chuàng)新型多色流式分析解決方案

簡化多色流式分析流程

ColorWheel^® 流式抗體和染料組合采用專為流式細(xì)胞術(shù)優(yōu)化的專（禾刂）技術(shù)，支持用戶分別選擇抗體和染料并根據(jù)自身需要任意組合，在保證實驗成功率的同時又可幫助簡化流式細(xì)胞分析流程，突破傳統(tǒng)流式分析方案的局限。

主要優(yōu)勢：

突破局限：可靈活選擇抗體和染料進行搭配組合，解鎖多色流式分析的無限可能。

簡化流程：簡單三步操作即可制備即用型抗體-染料溶液，實操時間不超過 5 分鐘。

高效穩(wěn)定：單克隆抗體兼?zhèn)涓咛禺愋院涂芍貜?fù)性，凍干粉形式增強運輸和儲存穩(wěn)定性。

潔凈兼容：無防腐劑，兼容的樣品類型更廣。

ColorWheel^® 技術(shù)基于專（禾刂）的寡核苷酸配對連接技術(shù)將抗體與染料偶聯(lián)起來（詳見圖 3），偶聯(lián)產(chǎn)物與熒光標(biāo)記的直標(biāo)抗體保持一致，可以直接用于流式的標(biāo)記檢測。該技術(shù)的偶聯(lián)過程只需要簡單的 1:1 的混合，其偶聯(lián)過程比起傳統(tǒng)的抗體標(biāo)記方法大大簡化。ColorWheel^® 流式抗體的選擇靈活性能讓使用者更加靈活的設(shè)計多色方案，擺脫由于抗體熒光組合缺失導(dǎo)致的配色困境（詳見表 2）。

圖 3 ColorWheel 流式抗體偶聯(lián)技術(shù)示意

表 2 Colorwheel^® 助力突破傳統(tǒng)多色流式分析的局限

傳統(tǒng)方法	傳統(tǒng)方法的局限	Colorwheel^® 方案
標(biāo)記一抗	同時需要目標(biāo)抗體以及與儀器兼容的染料	支持任意ColorWheel® 抗體和染料的組合，操作更靈活
標(biāo)記二抗	需要多次反復(fù)洗滌，存在交叉反應(yīng)性問題	ColorWheel® 抗體和染料通過 3 步即可完成結(jié)合反應(yīng)，盡可能降低復(fù)雜物種反應(yīng)性和反復(fù)洗滌引起的抗體損失風(fēng)險
標(biāo)記試劑盒	耗費更多時間和成本，并導(dǎo)致數(shù)據(jù)波動	ColorWheel® 抗體和染料無需額外的標(biāo)記試劑盒，既節(jié)省時間，又節(jié)省成本，并可規(guī)避標(biāo)記步驟帶來的數(shù)據(jù)誤差

應(yīng)用舉例：

ColorWheel^® 不僅可以簡化流式細(xì)胞分析流程，突破傳統(tǒng)流式分析方案的局限，同時可以保證在多重指標(biāo)的流式實驗中具有優(yōu)異的表現(xiàn)。

以下實驗檢測了免疫 T 細(xì)胞檢測常用的指標(biāo) CD3，CD4，CD44，CD45RA，該 4 重指標(biāo)的實驗用來評估 CD4+ 輔助型T細(xì)胞的激活狀態(tài)。結(jié)果顯示，ColorWheel^® 流式抗體與傳統(tǒng)的流式抗體具有同樣優(yōu)異的表現(xiàn)（詳見圖 4）。

圖 4 ColorWheel 流式抗體與傳統(tǒng)流式抗體的檢測效果比較（左邊是 ColorWheel^® 結(jié)果，右邊是傳統(tǒng)數(shù)據(jù)）

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