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ELISA實(shí)驗(yàn)操作中值得關(guān)注的細(xì)節(jié)大盤點(diǎn)
發(fā)布時(shí)間: 2021-09-10 點(diǎn)擊次數(shù): 1426次酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA)因其具有敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn),被廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)中的各種抗原和抗體的測(cè)定。盡管 ELISA 操作簡(jiǎn)單,但是小實(shí)驗(yàn)里也蘊(yùn)含著大文章,ELISA 操作各個(gè)環(huán)節(jié)對(duì)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)效果影響較大,稍不注意就會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果?,F(xiàn)在就跟大家 818 應(yīng)用 ELISA 應(yīng)該了解的一些常識(shí)。
ELISA 分類及具體過(guò)程
一般,ELISA 可分為以下四大類:直接 ELISA、間接 ELISA、夾心 ELISA、競(jìng)爭(zhēng)抑制 ELISA。其他的 ELISA 都隸屬于這四類 ELISA 或由這四類 ELISA 組合衍生。下面分析 ELISA 實(shí)驗(yàn)操作中可能影響結(jié)果的原因,并給出相應(yīng)的解決方法。
樣品收集和保存
用于 ELISA 測(cè)定較為常用的臨床標(biāo)本是血清(漿)。要注意避免嚴(yán)重溶血,因?yàn)檠t蛋白中含有具有類似過(guò)氧化物活性的血紅素基團(tuán),在孵育時(shí)很容易吸附于固相,與 HRP 底物反應(yīng)產(chǎn)生假陽(yáng)性。
樣品采集及血清分離中要注意避免細(xì)菌污染,一方面細(xì)菌分泌的酶可能對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用,另一方面,細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的 β-半乳糖苷酶會(huì)對(duì)相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。
樣品應(yīng)該要避免反復(fù)凍融。因反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用,從而引起假陰性結(jié)果。另外,樣品混勻時(shí),不要?jiǎng)×艺袷?,反?fù)顛倒混勻即可。
一般而言,如果在收集樣品的當(dāng)天進(jìn)行檢測(cè),可將樣品及時(shí)儲(chǔ)存在 4℃?zhèn)溆?;而?duì)隔天再檢測(cè)的樣本,應(yīng)及時(shí)分裝后凍存在-20℃?zhèn)溆?,若要長(zhǎng)期保存樣品,最好將其置于-70℃凍存。
試劑準(zhǔn)備
在實(shí)驗(yàn)開始前,需將試劑盒從冰箱中拿出來(lái)在室溫放置 20min,再進(jìn)行測(cè)定,以使試劑盒在 使用前與室溫平衡,也可使溫育時(shí)反應(yīng)孔內(nèi)的溫度能較快的達(dá)到所要求的高度,以滿足測(cè)定 要求。
其次,目前商品中 ELISA 試劑盒中的洗板液均需在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)其所提供的濃縮液進(jìn)行稀釋 配制,因此稀釋時(shí)所用的蒸餾水或去離子水應(yīng)該保證質(zhì)量。此外,底物反應(yīng)液應(yīng)該反應(yīng)顯色 前進(jìn)行現(xiàn)配現(xiàn)用。同時(shí),為了保證實(shí)驗(yàn)的均一性,實(shí)驗(yàn)中所有試劑在加樣前必須搖勻。
加樣
因 ELISA 的靈敏度較高,則應(yīng)該按規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù),以降低非特異性反應(yīng),使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來(lái)。
加樣品時(shí),單孔用量要求:≥20ul/指標(biāo),如需要做 2 個(gè)復(fù)孔則血量≥60ul/指標(biāo)。如果用量充足,最好提供 50ul/孔/指標(biāo)。具體用量也需根據(jù)試劑盒的要求而定。
吸取樣品時(shí),加樣槍頭不應(yīng)粘附多余的液體;加樣時(shí)不可 90 度向孔中滴加液體,否則會(huì)導(dǎo)致液體殘留在吸頭上,加樣不準(zhǔn)確。正確加樣方法應(yīng)為 45 度,吸頭貼著孔壁和液面的交界處加入。
加樣時(shí)速度不可過(guò)快,否則無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性;要避免樣品加在孔壁上部而產(chǎn)生非特異性吸附。不可將樣品濺出以避免對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。
孵育
一般,孵育時(shí)間與溫度成反比,即溫度越高,所需時(shí)間相對(duì)較短。較為常用的孵育溫度為 37℃,孵育 1-2h。
孵育時(shí)應(yīng)貼封片或加蓋,避免樣品或稀釋液蒸發(fā),吸附于孔壁,難于清洗。孵育時(shí),反應(yīng)板不宜疊放,以保證各板的溫度都能迅速平衡。同時(shí),應(yīng)嚴(yán)格控制孵育時(shí)間,避免因時(shí)間過(guò)長(zhǎng)導(dǎo)致緊附于反應(yīng)孔周圍的非特異性結(jié)合。
孵育時(shí),要盡量排除“邊緣效應(yīng)",即 96 孔板的外周孔顯色較中心孔深。究其原因,是因?yàn)?96 孔板周孔與中心孔的表面或熱力學(xué)特征不同。因此,可采用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時(shí),將板和溶液均加熱至孵育溫度(37℃)。
洗板
為了確保 ELISA 測(cè)定的特異性,洗板可清除非特異性結(jié)合物質(zhì),減少背景信號(hào),增加分析的信噪比。
手工洗板時(shí),拍板要垂直,避免交叉污染,用力不能過(guò)猛,防止抗原抗體復(fù)合物脫離。使用半自動(dòng)洗板時(shí),應(yīng)經(jīng)常檢查沖洗頭是否通暢,若被雜物堵塞時(shí)可用注射器針頭挑出。為了達(dá)到較好的洗滌效果,實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,即在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板 1-2 次。
以 HRP 作為標(biāo)記酶的 ELISA 試劑盒中使用的洗板液一般為含 0.05% Tween20 的中性 PBS,其中,吐溫 20 的濃度可在 0.05%-0.2%之間,高于 0.2%時(shí),可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低實(shí)驗(yàn)的靈敏度。
顯色
目前以 HRP 作為標(biāo)記酶的商品 ELISA 試劑盒中,如以 TMB 為底物,則提供的底物為 A 和 B 兩瓶應(yīng)用液;如以 OPD 為底物,則試劑盒提供 OPD 片劑或粉劑,臨用前配制。顯色劑配制后放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(肉眼可見淺藍(lán)色的 TMB 時(shí))要棄之不用。
在加入底物開始顯色反應(yīng)前,最好是先檢查一下底物溶液的有效性,即可將 A 和 B 兩種液各加一滴于清潔的空板孔或 eppendorf 管中,觀察是否有顯色出現(xiàn),如有,則說(shuō)明底物已變質(zhì)。
顯色反應(yīng)條件一般為 37℃或室溫反應(yīng) 15-30 分鐘。加終止液時(shí),要避免氣泡產(chǎn)生而引起的假陽(yáng)性。
讀板
讀板時(shí)要保證酶標(biāo)板清潔,同時(shí)也要注意酶標(biāo)儀的波長(zhǎng)是否已調(diào)至合適或所用濾光片是否正確。
通常,單波長(zhǎng)讀板的測(cè)定值一般是指以對(duì)顯色具有最大吸收的波長(zhǎng)如 450nm 或 492nm 進(jìn)行比色測(cè)定;而雙波長(zhǎng)讀板的測(cè)定值一般是敏感波長(zhǎng)如 450nm 的吸光值與非敏感波長(zhǎng)下如 630nm 的吸光值之差,可排除板內(nèi)臟物的影響。
同時(shí),由于 ELISA 測(cè)定中單個(gè)空白孔的非特異吸收上有一定程度的不確定性,也就是說(shuō)每次測(cè)定或同次測(cè)定空白孔位置的不同均有可能得到不同吸光度測(cè)定值,故而在 ELISA 測(cè)定比色時(shí),最好是使用雙波長(zhǎng)比色。
數(shù)據(jù)結(jié)果分析
ELISA 的測(cè)定結(jié)果可分為兩種:定性測(cè)定和定量測(cè)定。前者只需確定陰性或陽(yáng)性即可;后者則需要給具體的數(shù)值。在定量測(cè)定中,經(jīng)常要將標(biāo)準(zhǔn)品所獲得的吸光值進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。
下面則簡(jiǎn)單介紹用 excel 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法
1)輸入相應(yīng)數(shù)據(jù)
2)選中相應(yīng)數(shù)據(jù)
3)選擇表格中,菜單欄中的插入|散點(diǎn)圖中第一個(gè)類型
4)選中“圖表工具"中的“快速布局"中 fx 圖標(biāo),即可得到以下圖表。Excel 版本較低的可以直接跳到第 6)步。
5)點(diǎn)中坐標(biāo)軸標(biāo)題,可做修改。修改后可獲得以下標(biāo)準(zhǔn)曲線。
6)或者在較低版本的 excel 中,在“圖表工具"選項(xiàng)中,選擇趨勢(shì)線|線性趨勢(shì)線。
7)選中圖表中的趨勢(shì)線,右鍵,選擇“設(shè)置趨勢(shì)線格式",在彈出的對(duì)話框中,將“顯示公式" 勾選上,點(diǎn)擊關(guān)閉,也獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線。
8)可將試驗(yàn)管中所測(cè)的吸光度值代入圖表中的公式 Y=1.001x+0.0171 后可得到所求成分的含量,即 X 的值。
ELISA 的疑難雜癥
1)顯色淺,靈敏度低
2)假陽(yáng)性多,本底高甚至花板
3)重復(fù)性不好
4)白板
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