酶切，作為一種常用的分子克隆的手段，如果應(yīng)用得當，可謂寶刀屠龍，無往而不利；如果應(yīng)用不當，又會步步維艱。真是讓人歡喜讓人憂愁。酶切，最常見的問題就是切不動和切過了。這些問題比較復(fù)雜。下面，先講一講切不動的問題。

切不動可能的原因：

1. 酶不匹配

解決的方法：如果是雙酶切 A 和 B，預(yù)實驗中必須做 A 和 B 各自的單酶切和 A+B 的雙酶切, 好確認這幾種酶都好用，質(zhì)粒上的切點都好用。

2. 體系的問題

解決的方法：酶切盡量用大體系，如 50ul、100ul 等。大體系能稀釋內(nèi)切酶包裝中的甘油，對反應(yīng)有利。

3. 酶的量太少

解決的方法：當設(shè)計一個酶切時，限制性內(nèi)切酶的用量是與 DNA 分子的大小和量密切相關(guān)的。根據(jù)每種酶的單位定義，精確計算出所需的限制性內(nèi)切酶的量。不要簡單的套用酶說明書中的“通用酶切方案“，那個通用酶切方案是很多酶切切不動的原因。這里，小編隆重推薦一款酶切利器：3D(Double Digestion Designer)。該軟件的一個主要功能就是根據(jù)不同限制性內(nèi)切酶的單位定義，以及你底物 DNA 分子的大小以及 DNA 的量（ug數(shù)）來精確計算出*酶切你的 DNA 底物所需要的酶量，為*酶切提供夯實保證。

4. 酶失活 

如果限制性內(nèi)切酶因為保管不當，導(dǎo)致酶失活或部分失活，那么依據(jù) 3D 計算出來的酶量就不能保證*酶切。解決的方法：保管好你的酶。如果過期了，就不要用了。

5.DNA 的問題 

如果制備的質(zhì)粒 DNA 的質(zhì)量不好（如細菌培養(yǎng)時間過長，質(zhì)粒制備時裂解不充分或裂解時間過長等），那么對這種質(zhì)粒 DNA 進行酶切時，即使酶活性正常，酶量足夠，也不能實現(xiàn)*酶切，因為其中很多質(zhì)粒 DNA 已經(jīng)變性，不能被切開。

下面，給大家看一個簡單的實例。 

如果要用 AcsAB + pSB1C3 對質(zhì)粒 DNA 進行雙酶切，以便進行某基因的克隆。 

那么，應(yīng)該同時設(shè)計并進行三種酶切反應(yīng)：

A: AcsAB + pSB1C3 雙酶切 

B: AcsAB 單酶切 

C: pSB1C3 單酶切 

在酶切時，A，B，C 三種酶切反應(yīng)都用相同的 buffer 系統(tǒng)，相同的 DNA 量（建議至少 0.5ug），所需的酶量用 3D 進行計算。在合適的溫度（37°C）酶切 1～2 個小時，然后進行電泳分析。電泳分析時，添加兩種對照：未酶切的質(zhì)粒 DNA 和分子量標準（Marker）。

根據(jù)電泳的結(jié)果，就可以知道酶切是否*：

如果一切正常，*酶切后電泳的條帶分布如下： 

1.單酶切(B 和 C)應(yīng)該只有一條線性化的 DNA 條帶，其大小與質(zhì)粒的理論長度一致； 

2.未進行酶切的質(zhì)粒 DNA 應(yīng)該主要是一條超螺旋條帶，其電泳位置應(yīng)該在單酶切產(chǎn)生的線性 DNA 分子的前面。(有的質(zhì)粒會在超螺旋條帶的后面出現(xiàn)線性化條帶和環(huán)狀 DNA 條帶）； 

3.雙酶切的條帶應(yīng)該只有一條帶，而且大小與單切的位置一樣(注意：只有當兩個酶切位點間沒有大片段插入時，才如此。事實上，大部分質(zhì)粒的多克隆位點都是如此)。

如果出現(xiàn)以下的情況，就表明有問題： 

1.單酶切后（B 和/或 C），與未酶切的 DNA 樣品(D)的電泳位置一樣（即依然為超螺旋） 

2.出現(xiàn)線性化質(zhì)粒及超螺旋質(zhì)粒兩條帶。這意味著：AcsAB 和/或 pSB1C3 未能*切開，原因可能是酶部分失活，或者質(zhì)粒的質(zhì)量有問題。此時，即使雙酶切只出現(xiàn)一條線性化 DNA 條帶，也可能在線性化質(zhì)粒中存在大量的單酶切的載體。 用此種載體進行克隆，則在連接時會出現(xiàn)大量的單酶切載體的自連（載體自連的效率較雙片段連接高 10 倍以上），導(dǎo)致大量的自連克隆，很難挑選到有插入的克隆（克隆失?。Ｈ绻霈F(xiàn)此種現(xiàn)象，建議不要盲目地做下去。應(yīng)該先停一停，首先逐一查找可能的原因。只有當上述兩種可能的問題都解決了，才能保證*酶切，進而獲得正確的克隆。

以上是酶切的常規(guī)經(jīng)驗，當然還是會有特例比較難做，因為其中涉及到酶量的計算，Buffer 的選擇，反應(yīng)體積，反應(yīng)條件等多種條件摸索。一旦出現(xiàn)問題，大家需要耐心細致，逐一查找可能的原因。